Nederlandse onderzoekers combineren CRISPR en bioluminescentie in een experimentele test voorinfectieziekten

Een nieuw ontwikkeld nachtelijk eiwit zou volgens onderzoekers in Nederland de diagnose van virusziekten kunnen versnellen en vereenvoudigen.
Hun studie, woensdag gepubliceerd in ACS Publications, beschrijft een gevoelige, eenstapsmethode voor het snel analyseren van virale nucleïnezuren en hun uiterlijk met behulp van gloeiende helderblauwe of groene eiwitten.
De identificatie van ziekteverwekkers door het detecteren van hun nucleïnezuurvingerafdrukken is een sleutelstrategie in de klinische diagnostiek, biomedisch onderzoek en het monitoren van de voedsel- en milieuveiligheid.De veelgebruikte kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR)-tests zijn zeer gevoelig, maar vereisen een geavanceerde monstervoorbereiding of interpretatie van de resultaten, waardoor ze onpraktisch zijn voor sommige gezondheidszorginstellingen of omgevingen met beperkte middelen.
Deze groep uit Nederland is het resultaat van een samenwerking tussen wetenschappers van universiteiten en ziekenhuizen om een ​​snelle, draagbare en eenvoudig te gebruiken diagnostische methode voor nucleïnezuren te ontwikkelen die in verschillende omgevingen kan worden toegepast.
Ze zijn geïnspireerd door vuurvliegflitsen, vuurvlieggloed en kleine sterren van waterfytoplankton, allemaal aangedreven door een fenomeen dat bioluminescentie wordt genoemd.Dit glow-in-the-dark-effect wordt veroorzaakt door een chemische reactie waarbij het luciferase-eiwit betrokken is.De wetenschappers verwerkten luciferase-eiwitten in sensoren die licht uitstralen om observatie te vergemakkelijken wanneer ze een doelwit vinden.Hoewel dit deze sensoren ideaal maakt voor point-of-care-detectie, missen ze momenteel de hoge gevoeligheid die nodig is voor klinische diagnostische tests.Hoewel de CRISPR-methode voor het bewerken van genen deze mogelijkheid kan bieden, zijn er veel stappen en aanvullende gespecialiseerde apparatuur nodig om het zwakke signaal te detecteren dat aanwezig kan zijn in complexe, luidruchtige monsters.
Onderzoekers hebben een manier gevonden om een ​​CRISPR-gerelateerd eiwit te combineren met een bioluminescent signaal dat kan worden gedetecteerd met een eenvoudige digitale camera.Om er zeker van te zijn dat er voldoende RNA- of DNA-monster was voor analyse, voerden de onderzoekers recombinase-polymerase-amplificatie (RPA) uit, een eenvoudige techniek die werkt bij een constante temperatuur van ongeveer 100 ° F.Ze ontwikkelden een nieuw platform genaamd de Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), waarin de twee CRISPR/Cas9-eiwitten specifiek zijn voor verschillende aaneengesloten delen van het virale genoom, elk met een uniek luciferasefragment erboven aan vastgemaakt.
Wanneer het specifieke virale genoom dat de onderzoekers onderzoeken aanwezig is, binden twee CRISPR/Cas9-eiwitten zich aan de doelnucleïnezuursequentie;ze komen dicht bij elkaar, waardoor intact luciferase-eiwit zich kan vormen en blauw licht kan uitzenden in de aanwezigheid van een chemisch substraat..Om rekening te houden met het substraat dat tijdens dit proces werd verbruikt, gebruikten de onderzoekers een controlereactie die groen licht uitstraalde.Een buis die van kleur verandert van groen naar blauw duidt op een positief resultaat.
De onderzoekers testten hun platform door de RPA-LUNAS-test te ontwikkelen, die detecteertSARS-CoV-2-RNAzonder vervelende RNA-isolatie, en demonstreerde zijn diagnostische prestaties op nasofaryngeale uitstrijkjes vanCOVID 19patiënten.RPA-LUNAS heeft met succes SARS-CoV-2 binnen 20 minuten gedetecteerd in monsters met een RNA-viral load van slechts 200 kopieën/μl.
De onderzoekers geloven dat hun test gemakkelijk en effectief vele andere virussen kan detecteren.“RPA-LUNAS is aantrekkelijk voor het testen van infectieziekten op de zorglocatie”, schreven ze.